Analisi dei tocoferoli



HPLC - foto Lab. ITI
 PREMESSA: gli antiossidanti, generalmente presenti  nei grassi e negli oli, conferiscono loro una resistenza all'ossidazione assai superiore a quella dei trigliceridi puri. Importanti composti antiossidanti sono i tocoferoli (identici alla vitamina E), presenti in quasi tutte le sostanze grasse: la protezione dall'ossidazione esercitata dai tocoferoli, nei riguardi del grasso, è dovuta al fatto che questi composti sono facilmente ossidabili, catturando i radicali liberi che si formano durante l'ossidazione all'aria dei composti insaturi, ed ha le stesse funzioni sia nei cibi che nel tessuto cellulare.
Nella frazione INSAPONIFICABILE degli oli risulta la VITAMINA E importante come antiossidante, per esempio protegge dalla ossidazione/perossidazione i grassi interagendo con O2 e con i radicali liberi, promuove l'utilizzazione della Vitamina A e la sintesi dell'eme (aumentando i livelli degli enzimi delta-aminolevulinico-sintetasi e deidratasi). È usata come coadiuvante nell'aterosclerosi e nella sterilità, ed è un noto antiabortivo. La carenza causa fragilità dei globuli rossi e sintomi neurologici, oltre a distrofia muscolare).
Per la delerminazione, negli oli, dei tocoferoli naturali, nelle varie forme isomeriche e dell'alfa-tocoferil acetato è stato sviluppato un metodo che fa uso della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC).

epoca di raccolta
e proprietà
 Il sistema cromatografico impiegato fa uso di una colonna RP-18, con particelle da 10 micro, di una fase mobile costituita da metanolo/acqua (96:4) e di un rivelatore spettrofotometrico UV a lunghezza d'onda variabile (288 nm). I campioni da analizzare vengono disciolti in acetato di etile e dopo filtrazione (0,45 micro) vengono iniettali direttamenle in colonna.
Questo metodo consente di determinare la composizione tocoferolica sia di oli di semi raffinati che greggi. ( Tonolo Marzo - LA RIVISTA DELLE SOSTANZE GRASSE VOL. LXVI 1/89)
PARTE SPERIMENTALE
Apparecchiatura: Cromatografo Liquido mod. 1082 B, Hewlelt-Packard equipaggiato con LC Terminai 79850 B per la raccolta e l'elaborazione dei dati e rivelatore UV, mod. 79875 A-HP a lunghezza d'onda variabili -Colonna Erbasil RP-18, 10 micro, 250 x 4,6 mm d.i., Carlo Erba.
Materiali e reagenti:
vetreria: matracci tarati da 25 ml, cilindri graduati da 100 e 500 ml, sistema per la filtrazione dei solventi sotto vuoto, fialette da 2 ml;
solventi: -Metanolo RS per HPLC-Analyticals.. Carlo Erba. -Acetato di etile: RS per HPLC-Analyticals, Carlo Erba. -Acqua bidistillata e filtrata (0,45 micro).
filtrazione dei solventi:
-Filtri HVLP Millipore da 0,5 micro, diametro 47 mm e 12 mm; -Siringa Luer Lock da 5 mi; -Swinney filter holder, Millipore.
Preparazione della fase mobile
-Solvente A: acetato di etile, filtrato su HVLP da 0,5 micro -Solvente B: miscela metanolo acqua, 96/4 (v/v).
Aggiungere a 960 ml di metanolo 40 ml di acqua; filtrare la miscela su filtro HVLP da 0,5 micro. Sia il solvente A che il solvente B vanno degasati per 5-10 minuti con un bagno ad ultrasuoni.
Standards
-d,l-gamma-tocoferolo, Supelco -d,l-alfa-tocoferolo, Fluka -d,l-alfa-tocoferil acetato, Roche
Di ogni singolo tocoferolo viene preparata una soluzione da 1000 microg/ml pesando 50 mg di sostanza in un matraccio tarato da 50 ml e portando a volume con acetato di etile. La soluzione standard impiegata per la calibrazione dello strumento si prepara aggiungendo rispettivamente: 2 mi dì gamma tocoferolo, 1 ml di alfa-tocoferolo ed 1 ml di alfa tocoferil acetato in un matraccio tarato da 25 ml e portando a volume con acetato di etile. In questa soluzione si possono aggiungere 5 mg di BHT come antiossidante. Questa soluzione viene preparata fresca all'inizio di ogni settimana e deve essere conservata in frigorifero al riparo dalla luce. Per il calcolo dei fattori e della linearità della risposta sono state preparate 5 soluzioni con una gamma di concentrazioni comprese fra i 10 ed i 150 microg/ml. Come si può vedere nella figura 1 la risposta è lineare nell'intervallo di concentrazione studiato (i coefficienti di correlazione per le tre rette sono rispettivamente di: (a) 0,9999; (b) 0,9998; (c) 0,9995). Non disponendo di uno standard puro di delta-tocoferolo abbiamo assunto come fattore di risposta per questo tocoferolo quello dell'alfa tocoferolo in quanto i loro coefficienti di estinzione specifica sono molto simili.

fig 1
Preparazione dei campioni
Si pesano esattamente circa 2,5 g di olio in un matraccio tarato da 25 ml e si diluiscono a volume con acetato di etiie Circa 2 ml di campione vengono filtrati su filtro Millipore HVLP da 0,5 micro, diam.12 mm, mediante lo Swinney filter holder ed una siringa Luer-Lock da 5 ml, in una fialetta da 2 ml.
Condizioni strumentali
-Flusso: 1,6 ml/min; -Temperatura del forno: 40°C; -Rivelatore UV: 288 nm (s)/464 nm (r); -Volume iniettato: 10 o 20 microlitri.
L'eluizione dei tocoferoli viene effettuata pompando 1,6 ml di fase mobile B (metanolo/acqua) per 12 min. Dopo 1 o 2 iniezioni la colonna viene lavata dal materiale lipidico con acetato di etile (solvente A) utilizzando il seguente programma di gradiente:
1. Acetato di etile dallo O a1 100% in 3 minuti.
2. Mantenere il 100% di acetato di etile per 5 minuti.
3. Portare la percentuale di acetato di etile dal 100 allo 0% in 3 minuti.
4. Lasciar riequilibrare la colonna con la fase mobile B per circa 10 minuti prima di iniettare il campione successivo.
La calibrazione dello strumento viene ricontrollata durante la giornata iniettando lo standard ed eventualmente ricalibrando con il metodo della media pesata.
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